• 病毒RNA提取實(shí)驗
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    病毒RNA提取實(shí)驗


    病毒RNA提取可以:(1)用于RNA病毒復制機制研究;(2)用于反向遺傳學(xué)研究;(3)用于分子病毒學(xué)其他研究。

    詳細

    實(shí)驗方法

    實(shí)驗方法
    • TE-飽和酚/氯仿提取法

    實(shí)驗方法原理大多植物病毒RNA 為單鏈RNA ,并且其極性與mRNA 極性相同,植物病毒RNA 提取較為簡(jiǎn)單,一般使用酚氯仿即可獲得滿(mǎn)意結果。 
    實(shí)驗材料
    試劑、試劑盒
    儀器、耗材
    抗體
    實(shí)驗步驟
    一、實(shí)驗材料準備

    1.  材料
     
    提純TMV病毒液(10 mg/ml)。
     
    2.  設備
     
    冷凍臺式離心機,低溫真空干燥儀,電泳儀,電泳槽。
     
    3.  試劑
     
    TE-飽和酚:氯仿(1:1),氯仿,3 M NaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE緩沖液,無(wú)RNA 酶的雙菌水。
     
    二、操作步驟
     
    1.  取一eppendorf管加入提純TMV(10 mg/ml)400 ml,再加入等體積酚/氯仿,蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘,4℃下12 000 g離心10分鐘。
     
    2.  吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有機相交界面無(wú)蛋白為止。
     
    3.  吸取水相于新eppendorf心管,加入等體積氯仿,用手倒置離心管數十秒,4℃下12 000 g離心10分鐘。
     
    4.  取水相,加入1/10倍體積的3 mol/L NaAc(pH5.2),2.5倍體積的冰冷乙醇,混勻,-20℃30分鐘。
     
    5.  4℃下12 000 g離心15分鐘,小心棄去上清液,用70%乙醇洗滌沉淀,4℃下12 000 g離心5分鐘。
     
    6.  小心棄去上清液,沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘,并溶于無(wú)RNA 酶的雙菌水或TE緩沖液中。
     
    7.  取10 ml進(jìn)行電泳分析。
     
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    注意事項
    1.  整個(gè)操作應盡可能在低溫下進(jìn)行。
     
    2.  由于病毒RNA 鑲嵌于外殼蛋白里面,因此要充分剝去病毒外殼蛋白,一般需要多次進(jìn)行酚/氯仿的抽提。

     

    上海金畔生物科技有限公司

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